在实际工作中，在金溶胶中加入蛋白质后，会由于静电、疏水和范德华力相互作用而引发其在金颗粒表面的自发吸附，这是胶体金标记得以进行的基础。离开这个基础，胶体金标记是没办法进行的。
为(wei)(wei)了(le)(le)制备(bei)金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)标记的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)质(zhi)，通(tong)常(chang)(chang)先将将金(jin)悬浮液(ye)(ye)搅拌混匀（你肯定遇(yu)到过这(zhei)种(zhong)情况：如果(guo)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)比(bi)较(jiao)大(da)，放置一段(duan)时间会(hui)出(chu)现颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)下(xia)沉(chen)，注意此(ci)处不(bu)是(shi)(shi)金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)形(xing)态发生(sheng)变化导致的(de)(de)(de)聚(ju)(ju)沉(chen)！而(er)只是(shi)(shi)因(yin)为(wei)(wei)重(zhong)力(li)作用(yong)(yong)引(yin)起的(de)(de)(de)正常(chang)(chang)金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)在(zai)溶液(ye)(ye)中的(de)(de)(de)非均(jun)匀分布。因(yin)此(ci)标记时候需(xu)要混匀后(hou)(hou)使(shi)用(yong)(yong)），同时加入大(da)量的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)质(zhi)。当金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)与蛋(dan)(dan)白(bai)质(zhi)分子结合时，随着金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)变得稳定和(he)裸金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)的(de)(de)(de)减少，特(te)征(zheng)波长处的(de)(de)(de)吸(xi)光(guang)度(du)通(tong)常(chang)(chang)会(hui)下(xia)降。为(wei)(wei)了(le)(le)检(jian)查吸(xi)附过程的(de)(de)(de)完(wan)整性(xing)，并确定金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)是(shi)(shi)否完(wan)全被饱和(he)标记，我们可以取一部分液(ye)(ye)体(ti)，并加入少量氯(lv)化钠溶液(ye)(ye)。如果(guo)在(zai)加入氯(lv)化钠后(hou)(hou)发生(sheng)聚(ju)(ju)沉(chen)，则(ze)说明(ming)金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)还(hai)有没被蛋(dan)(dan)白(bai)吸(xi)附存在(zai)比(bi)较(jiao)多的(de)(de)(de)裸金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)，应(ying)该添加更多的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)质(zhi)来进一步吸(xi)附裸金(jin)颗(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)。最后(hou)(hou)，通(tong)常(chang)(chang)会(hui)添加聚(ju)(ju)乙二醇（PEG）或免(mian)疫(yi)反(fan)应(ying)阻断剂，如BSA或脱脂奶粉溶液(ye)(ye)，来进一步稳定蛋(dan)(dan)白(bai)质(zhi)结合后(hou)(hou)的(de)(de)(de)胶体(ti)悬液(ye)(ye)。这(zhei)些封闭蛋(dan)(dan)白(bai)基本会(hui)完(wan)全占(zhan)据(ju)绝大(da)分部分潜在(zai)的(de)(de)(de)金(jin)-金(jin)复合物(wu)或金(jin)-蛋(dan)(dan)白(bai)复合物(wu)相互作用(yong)(yong)的(de)(de)(de)剩余(yu)位点，从而(er)防止了(le)(le)在(zai)存储、检(jian)测(ce)过程中的(de)(de)(de)聚(ju)(ju)集或非特(te)异性(xing)结合。
关于待标记蛋白用量，大部分研发人员通常的做法是：先确定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白质所需量，在此基础上增加约10-20%的过量蛋白（霍里斯伯格和罗塞特，1977；De Mey等人，1981）。但这个确定蛋白具体用量多少的工作其实针对大部分项目或者新手研发人员来说，已经没有太多必要去动手再确定到底多少蛋白才是最少量，除非是项目蛋白成本很高，你可以去做个试验往下走走好好降降成本。胶体金技术这么多年下来，N多的被后浪拍在沙滩上且已经被晒得嘎嘣脆的研发前辈早已经留下了适合绝大部分项目标记的蛋白使用量。通常来说10ug/ml的用量已经绝对能让你的蛋白丰度够到姥姥家了，笔者甚至试过3ug/ml的用量姥姥家都表示够用了。但是需要注意的是，如果你使用的金溶液浓度比较高的话，还是需要相应按照适当的比例提高蛋白的使用量，否则姥姥就有可能告诉你蛋白用量有点点不那么给力了。
总体来(lai)说，为了获得比较(jiao)理想的标记物之外，在(zai)用(yong)金颗粒标记蛋白质时，需要考虑(lv)几个参数：
(1)蛋白(bai)质(zhi)的pI，
(2)吸附过程的pH，
(3)标记反应中的(de)蛋白质(zhi)的(de)量(liang)。
一般认为，大多数蛋白质可(ke)以在其等电点(dian)或(huo)附近最大限度(du)(du)地和胶(jiao)体金(jin)颗粒进行吸(xi)附（Norde，1986）。但是就pH这(zhei)个参(can)数，在金(jin)标记(ji)过程(cheng)中再怎么强调也(ye)不(bu)(bu)为过，甚至可(ke)以说(shuo)“成也(ye)pH，败也(ye)pH”.这(zhei)个参(can)数对凭金(jin)标记(ji)这(zhei)个技能混江湖(hu)的(de)(de)人来说(shuo)绝对算得上是内家真(zhen)气般的(de)(de)存在。没(mei)有(you)一定(ding)程(cheng)度(du)(du)的(de)(de)修炼是不(bu)(bu)好去江湖(hu)随便飘的(de)(de)。甚至有(you)些待标记(ji)蛋白的(de)(de)纯度(du)(du)、性能决定(ding)了标记(ji)过程(cheng)pH会出现和常规做法特别不(bu)(bu)一样(yang)的(de)(de)要求，先(xian)举例说(shuo)明如下：
A、对于(yu)许多蛋白(bai)(bai)质(zhi)，特别(bie)是抗(kang)血清来源(yuan)的(de)免疫球蛋白(bai)(bai)，平均pI是一(yi)(yi)个包含一(yi)(yi)系列(lie)pH值(zhi)的(de)范围。因(yin)此，多克隆抗(kang)体制(zhi)备可能具有(you)与(yu)特定(ding)纯化的(de)单克隆抗(kang)体非常不同(tong)的(de)平均pI。这(zhei)一(yi)(yi)点(dian)相信广大(da)金标研发人员是有(you)所体会的(de)，通常就是多抗(kang)比较好标记(ji)(ji)，但是活性不尽如人意，单抗(kang)虽然没多抗(kang)好标，但标记(ji)(ji)出来后(hou)效果(guo)喜人。原因(yin)就在于(yu)此。
B、另(ling)外一(yi)点，个别蛋(dan)(dan)白(bai)对pH非常(chang)挑剔，当你(ni)(ni)用(yong)第一(yi)步调整好(hao)(hao)pH的(de)(de)(de)(de)金溶(rong)液(ye)中加入蛋(dan)(dan)白(bai)后(hou)，一(yi)切反(fan)应都很(hen)和谐、美好(hao)(hao)，反(fan)应的(de)(de)(de)(de)页面也很(hen)丝(si)滑(hua)，但当你(ni)(ni)第二(er)次加入封(feng)闭蛋(dan)(dan)白(bai)后(hou)满怀(huai)希望的(de)(de)(de)(de)等待收货(huo)美好(hao)(hao)的(de)(de)(de)(de)标(biao)记物(wu)时，诡异、惨烈(lie)的(de)(de)(de)(de)画面通常(chang)会出来把你(ni)(ni)英(ying)俊潇洒的(de)(de)(de)(de)脸摁花岗(gang)岩(yan)地面上摩(mo)擦一(yi)顿(dun)：你(ni)(ni)会发(fa)现溶(rong)液(ye)会慢(man)(man)慢(man)(man)的(de)(de)(de)(de)、逐(zhu)渐的(de)(de)(de)(de)变(bian)成(cheng)(cheng)蓝色(se)(se)、或者紫色(se)(se)，甚至会有沉淀析出，人品差的(de)(de)(de)(de)他(ta)最后(hou)直(zhi)接会给你(ni)(ni)变(bian)成(cheng)(cheng)一(yi)汪清水！咦，他(ta)怎(zen)么(me)就变(bian)色(se)(se)儿呢(ni)？他(ta)怎(zen)么(me)能变(bian)色(se)(se)了呢(ni)！问题是(shi)，你(ni)(ni)这一(yi)变(bian)色(se)(se)儿，你(ni)(ni)让你(ni)(ni)旁边新招(zhao)来的(de)(de)(de)(de)实验助手小妹妹对你(ni)(ni)那崇拜的(de)(de)(de)(de)眼神往何处安放？！是(shi)啊，他(ta)怎(zen)么(me)就变(bian)色(se)(se)儿了呢(ni)？其实，这个问题主(zhu)要是(shi)就是(shi)待带标(biao)记蛋(dan)(dan)白(bai)对pH非常(chang)敏感造成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)，加入封(feng)闭蛋(dan)(dan)白(bai)后(hou)改(gai)变(bian)了溶(rong)液(ye)pH所致(zhi)，需要你(ni)(ni)在加入封(feng)闭蛋(dan)(dan)白(bai)过程中持续稳定溶(rong)液(ye)的(de)(de)(de)(de)pH才能让标(biao)记过程进行下(xia)去(qu)。
就(jiu)算(suan)你(ni)(ni)确定好了(le)标记pH，咱们(men)通(tong)常会(hui)(hui)加入碳酸钾到(dao)金溶(rong)液里(li)边(bian)去，然(ran)后再(zai)搅拌。但是(shi)，我(wo)(wo)(wo)(wo)告诉你(ni)(ni)，你(ni)(ni)如果对(dui)你(ni)(ni)的(de)(de)pH计(ji)(ji)下手够狠的(de)(de)话，你(ni)(ni)可以用(yong)探头(tou)直接伸入到(dao)你(ni)(ni)的(de)(de)金溶(rong)液里(li)边(bian)，然(ran)后睁大眼睛瞅个(ge)(ge)faiwu分钟(zhong)，我(wo)(wo)(wo)(wo)保(bao)证你(ni)(ni)会(hui)(hui)看见(jian)(jian)一(yi)(yi)个(ge)(ge)魔幻的(de)(de)情况(kuang)(kuang)出现(xian)：你(ni)(ni)调整(zheng)好的(de)(de)金溶(rong)液的(de)(de)pH它就(jiu)像(xiang)遥远(yuan)星空的(de)(de)星光一(yi)(yi)样一(yi)(yi)闪(shan)(shan)一(yi)(yi)闪(shan)(shan)的(de)(de)在(zai)你(ni)(ni)眼前欻欻跳动并且一(yi)(yi)直往(wang)下降(jiang)(jiang)。通(tong)常faiwu分钟(zhong)估(gu)计(ji)(ji)至少(shao)能(neng)给你(ni)(ni)掉个(ge)(ge)0.5个(ge)(ge)pH！厉害吧，刺激(ji)吧？是(shi)不(bu)是(shi)又听到(dao)了(le)你(ni)(ni)那英俊的(de)(de)脸和花岗岩摩擦(ca)的(de)(de)呲呲声！开始(shi)我(wo)(wo)(wo)(wo)遇到(dao)这种(zhong)情况(kuang)(kuang)就(jiu)傻(sha)眼了(le)，心想：这啥(sha)情况(kuang)(kuang)哇(wa)(wa)！那啥(sha)、实(shi)验前我(wo)(wo)(wo)(wo)特意用(yong)清水洗手了(le)三遍呐！看见(jian)(jian)小偷偷东西我(wo)(wo)(wo)(wo)也喊了(le)呀！公交车上(shang)我(wo)(wo)(wo)(wo)也给老奶(nai)奶(nai)让座了(le)哇(wa)(wa)，过(guo)斑马线我(wo)(wo)(wo)(wo)也没闯红灯撒。卧槽，肯定是(shi)过(guo)马路(lu)的(de)(de)时候(hou)走(zou)在(zai)我(wo)(wo)(wo)(wo)身(shen)边(bian)的(de)(de)老奶(nai)奶(nai)我(wo)(wo)(wo)(wo)没扶她(ta)！其实(shi)不(bu)是(shi)我(wo)(wo)(wo)(wo)不(bu)想扶她(ta)，是(shi)她(ta)走(zou)路(lu)速度比我(wo)(wo)(wo)(wo)快！等你(ni)(ni)在(zai)心里(li)对(dui)心灵彻底来(lai)一(yi)(yi)次(ci)涤荡后，我(wo)(wo)(wo)(wo)们(men)来(lai)处(chu)理这个(ge)(ge)问题，原(yuan)则就(jiu)是(shi)：多次(ci)平衡(heng)(heng)，尽快结合。多次(ci)平衡(heng)(heng)控(kong)制pH的(de)(de)下降(jiang)(jiang)幅(fu)度，尽快结合缩(suo)短波动时间。
虽然我们(men)说(shuo)蛋(dan)白质与(yu)金颗粒(li)的标(biao)记(ji)没有(you)普遍一(yi)致(zhi)的标(biao)准，但可以通过(guo)遵(zun)循(xun)下面这些一(yi)般(ban)准则来提高标(biao)记(ji)过(guo)程的效率：
(1)在pH的(de)pI范围内或略高(gao)于(yu)pI；但在实(shi)际中(zhong)往(wang)往(wang)这个策略效(xiao)果(guo)一(yi)般，真(zhen)的(de)勇者往(wang)往(wang)出其不意(yi)而获得(de)意(yi)外之(zhi)喜。期待你(ni)(ni)也(ye)一(yi)样！大胆往(wang)往(wang)能让你(ni)(ni)成为整个实(shi)验室(shi)最靓(jing)的(de)仔！
(2)向(xiang)金颗粒注入的蛋白质(zhi)量比氯化钠破坏(huai)实验时(shi)略(lve)高（约10%）；
(3)避免蛋白质的高饱和，因为这(zhei)可(ke)能会促进(jin)结(jie)合(he)材料的浸出；这(zhei)点真的可(ke)以采(cai)纳，10ug/ml用量绝对(dui)姥姥家(jia)够(gou)了，甚至舅(jiu)舅(jiu)家(jia)也都够(gou)了。省时间可(ke)以直接用这(zhei)个(ge)量，省出宝(bao)贵时间给(ji)实验(yan)助手培训(xun)下理(li)论和实验(yan)注(zhu)意事项的细(xi)节它不香吗？
(4)通(tong)过(guo)测定溶液在特征波长(zhang)处的(de)(de)吸光度来评(ping)价金颗粒的(de)(de)吸附程度和聚沉(chen)程度；
(5)优化每个蛋(dan)白质-金颗粒(li)偶(ou)联物(wu)，来确(que)定胶体的(de)稳定性和(he)活性。优化工作(zuo)是(shi)个细活，需要花时(shi)间和(he)精力去做、熬，这是(shi)也绝大部分小白菜成长(zhang)为大神的(de)最好(hao)的(de)路、其实也是(shi)最好(hao)的(de)捷径。这个工作(zuo)相(xiang)当于在对标记(ji)工作(zuo)做PDCA持续改进，同时(shi)、他对你获取、维持实验(yan)室标记(ji)岗(gang)位(wei)(wei)的(de)王霸之(zhi)位(wei)(wei)有(you)举(ju)足(zu)轻(qing)重的(de)作(zuo)用，实践(jian)出(chu)真知，真知出(chu)权(quan)威。
如(ru)此，只要(yao)是在每(mei)次(ci)标记的过程中出现诡异事件，江湖(hu)的朋(peng)友会不约而同的翘首以盼且众望所归于你(ni)身(shen)上，希望你(ni)重出江湖(hu)，一剑定乾坤！当然也少不了收获你(ni)助手小妹(mei)妹(mei)那崇拜的眼光(guang)！
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