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如果说(shuo)Kary Mullis发明了聚(ju)合酶链式反应法将(jiang)生物学划(hua)分(fen)为前PCR时代(dai)和后PCR时代(dai)，那(nei)么数字PCR的产生将(jiang)分(fen)子检(jian)(jian)测(ce)(ce)划(hua)分(fen)为了(le)定性检(jian)(jian)测(ce)(ce)时代(dai)和定量检(jian)(jian)测(ce)(ce)时代(dai)。但是(shi)数字PCR检(jian)(jian)测(ce)(ce)≠定量检(jian)(jian)测(ce)(ce)，数字PCR只是(shi)一个工(gong)具，只有这(zhei)个工(gong)具具备了(le)定量检(jian)(jian)测(ce)(ce)的条件才能实现真正的定量检(jian)(jian)测(ce)(ce)，否则都是(shi)“伪(wei)定量”。

一、什么是定量检测

1.定性和定量检测

通俗的理解，定性检测是测定待测物的“质”，如物理、化学、生物等，鉴定其是与非，有和无；定量检测是测定待测物的“量”，如质量、长度、物质的量等等。

2.核酸检测方法中的定量检测方法

是否为定量(liang)检测(ce)(ce)不是以(yi)检测(ce)(ce)结果是否是数值为依据，对于核酸(suan)检测(ce)(ce)，OD260/280计算核酸(suan)浓度和荧(ying)光定量(liang)PCR都是定性检测(ce)(ce)方法；只有(you)数字PCR属于定量(liang)检测(ce)(ce)方法。

3.数字PCR的伪定量

数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR是(shi)一(yi)个定(ding)量(liang)工具，但是(shi)如(ru)果(guo)(guo)数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR方(fang)(fang)法没(mei)有经(jing)过充(chong)分验证，获得的(de)定(ding)量(liang)结(jie)(jie)果(guo)(guo)也只是(shi)个伪定(ding)量(liang)结(jie)(jie)果(guo)(guo)，或(huo)者结(jie)(jie)果(guo)(guo)不准确，或(huo)者偏差较大。目前(qian)在数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR推广和(he)使用(yong)中(zhong)最大的(de)问题就(jiu)是(shi)：数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR厂(chang)家只强调仪器的(de)硬件参(can)数(shu)(shu)(shu)（分割单元数(shu)(shu)(shu)、多通道和(he)开发(fa)的(de)系统）；用(yong)户将荧光定(ding)量(liang)PCR方(fang)(fang)法在不做方(fang)(fang)法优化(hua)和(he)验证的(de)情况下直接应(ying)用(yong)于数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR平台，最终的(de)结(jie)(jie)果(guo)(guo)是(shi)数(shu)(shu)(shu)字(zi)PCR成(cheng)为一(yi)个定(ding)量(liang)不准的(de)定(ding)性检测工具。

 4.计量溯源

 要实(shi)现(xian)定量，通常需将测量的结果与国际单位制SI单位联系起来。国际单位制的七个基本单位：长度(du)(du)（米）、质量（千(qian)克(ke)）、时间（秒）、电流（安培）、热力学(xue)温(wen)度(du)(du)（开尔文）、物质的(de)量（摩(mo)尔）和发(fa)光(guang)强度(du)(du)（坎(kan)德拉）。

 “具有计数特征的(de)量(liang)（包(bao)括(kuo)特定核酸(suan)序列的(de)拷(kao)贝）的(de)单(dan)位(wei)(wei)为(wei)1。单(dan)位(wei)(wei)为(wei)1的(de)单(dan)元本质上(shang)是(shi)任何单(dan)元系统的(de)一个(ge)元素。单(dan)位(wei)(wei)为(wei)1的(de)量(liang)可视为(wei)可溯源至SI 单(dan)位(wei)(wei)摩尔(er)。因此(ci)，可以通过适当的(de)、经过验证的(de)测量(liang)程序来得出对(dui)SI的(de)计量(liang)溯源性(xing)。”-ISO 20395：2019

  5.不确定度

追求真值和追求真理一样困难！定量检测的最大困难是测准，因为真值永远是求之而不得的，也是人类孜孜不倦努力的目标。我们当下能做到的是获得真值所在的区间，并不断缩小这个区间，这个区间就是不确定度，它包含了测量中所有产生的误差（不确定分量）。

1.数字PCR的原理

数字PCR是将核酸模板分布在等体积的多个分割单元中，使得一些分割单元包含模板而其它分割单元不包含模板，然后对目标序列进行PCR扩增并检测特定的PCR产物，通过阳性率和泊松分布计算获得模板中靶序列拷贝数浓度。数字PCR的核心原理就是有限稀释、终点PCR和泊松分布！

2.数字PCR的分类

按照单元分割的方式数字PCR分为液滴式数字PCR、芯片式数字PCR和微滴芯片式数字PCR：

2.2芯片式数字PCR：使用物理(li)分割的方法，将反应液分布(bu)到几万个微孔中(zhong)，以(yi)赛默飞、凯杰和罗氏为代表：

2.3微滴芯片式数字PCR：分割方式仍然是生成(cheng)油包水的微(wei)滴(di)，但(dan)是将微(wei)滴(di)形成(cheng)单层平铺到芯片上，以(yi)STILLA和(he)思(si)纳(na)福(fu)为代表：

3.泊松分布

很多(duo)人(ren)对数字PCR定(ding)量结(jie)(jie)果的(de)质疑(yi)往往来源(yuan)于(yu)(yu)泊松分(fen)布导致的(de)概(gai)率，由于(yu)(yu)以往的(de)核酸检测都(dou)是(shi)定(ding)性(xing)(xing)的(de)，人(ren)们已(yi)经(jing)习惯了阳性(xing)(xing)或(huo)者阴性(xing)(xing)的(de)“确(que)(que)(que)定(ding)性(xing)(xing)”结(jie)(jie)果，而不(bu)习惯于(yu)(yu)存在概(gai)率和不(bu)确(que)(que)(que)定(ding)度的(de)“不(bu)确(que)(que)(que)定(ding)性(xing)(xing)”结(jie)(jie)果。但是(shi)事实的(de)情况是(shi)越能计算出(chu)概(gai)率和不(bu)确(que)(que)(que)定(ding)区间的(de)结(jie)(jie)果越准确(que)(que)(que)，只(zhi)给(ji)出(chu)阴阳性(xing)(xing)的(de)结(jie)(jie)果越不(bu)准确(que)(que)(que)。

1.精密度Precision

精(jing)密度可(ke)分(fen)为方法的重复(fu)性（repeatability），中(zhong)间精(jing)密度（intermediate precision）和再现性（reproducibility）。在实验(yan)室内(nei)部验(yan)证时，应确(que)定方法的重复(fu)性和中(zhong)间精(jing)度。可(ke)以使用单因素方差分(fen)析(xi)（ANOVA），计算重复(fu)性。

2.线性Linearity

通过(guo)对预期核(he)酸(suan)量(liang)值(zhi)(zhi)与观察到(dao)的核(he)酸(suan)量(liang)值(zhi)(zhi)进行(xing)回归(gui)分析(xi)，以斜率和相关系数R来表征该范围内的线(xian)性度。

观察(cha)值(zhi)与期望(wang)(wang)值(zhi)的期望(wang)(wang)斜率(lv)为(wei)1.0，截距为(wei)（0,0）。建议斜率(lv)在0.95至(zhi)1.05之间。相关系数R2应大于0.99。

3.正确度Trueness 

测量正确度是该方法产生的无限个结果（即现实中的大量结果）的平均数与接受参考值间的一致程度。优先使用有证标准物质获取合适的参考值。

4.稳健性Robustness

在稳健性测试中，应研究相关方法参数中的小偏差对方法性能和测量结果的影响。可能影响方法结果的相关参数，如引物和探针的浓度、PCR试剂的成分、PCR仪和退火温度。

5.特异性specificity

应评估分(fen)析对预期目(mu)标的特异性(xing)(xing)以及与典型生物样品中可能存在(zai)的同(tong)源序(xu)列的潜在(zai)交叉反应性(xing)(xing)。

6.最低检测限limit of detection，LOD

可被检出的最低浓度。LOD在不同标准中有不同的计算方式，如：目视评价法，空白标准偏差法、标准方程法和信噪比法。对于数字PCR的LOD评估我个人比较倾向于使用空白标准偏差法评估LOD。

空白标准偏差法：既通过分析大量的样品空白或加入最低可接受浓度的样品空白来确定LOD。独立测试的次数应不少于10次，计算检测结果的标准偏差，计算方法见下表：

7.最低定量限limit of quantitation，LOQ

 样品中(zhong)的(de)分析(xi)物(wu)可被定量检测的(de)最(zui)低浓度。通常建议空白值加上10倍重(zhong)复(fu)性(xing)标准(zhun)偏差，也可以3倍的(de)LOD或(huo)高于方法确认中(zhong)使用最(zui)低加标量的(de)50%作为LOQ。

我从(cong)2012年就开始接触数字PCR，后来因为一直从(cong)事核酸(suan)标准物(wu)质的研(yan)究，需(xu)要不断的开发数字PCR的定量(liang)方法，目前已(yi)经使用过的数字PCR仪(yi)大概有(you)10种。

数字PCR本(ben)应定(ding)位(wei)为一个高灵(ling)敏度和准(zhun)(zhun)确度的(de)定(ding)量工具，各厂家应聚焦于如何提高仪器的(de)精密度和准(zhun)(zhun)确度，筛选最(zui)匹配的(de)反应体系(xi)，开(kai)放平(ping)台扶持专业的(de)方(fang)(fang)法开(kai)发(fa)者。但是(shi)(shi)目(mu)前的(de)一种不良倾向是(shi)(shi)大家都在(zai)拼硬(ying)件性能(neng)（微滴数更(geng)多(duo)，荧光通(tong)道更(geng)多(duo)），过度宣(xuan)传自(zi)己(ji)平(ping)台的(de)开(kai)放性和通(tong)用性，回避普通(tong)用户自(zi)己(ji)建立定(ding)量方(fang)(fang)法的(de)难(nan)度。硬(ying)生生把一个定(ding)量工具变成了(le)更(geng)灵(ling)敏的(de)定(ding)性或(huo)伪(wei)定(ding)量工具。数字PCR是(shi)(shi)时候回归真定量了！