PCR 扩(kuo)增 DNA 是实验室中常用(yong)(yong)的(de)基础技(ji)术，随(sui)着技(ji)术的(de)发展(zhan)，其应用(yong)(yong)范围不(bu)断扩(kuo)展(zhan)，包括临床检(jian)测(ce)。定量(liang) PCR (qPCR) 是一(yi)种可靠的(de)已建(jian)立的(de)方法(fa)，允许(xu)对靶 DNA 进(jin)行相对定量(liang)，例如基于 PCR 的(de)冠状(zhuang)病毒测(ce)试使用(yong)(yong) qPCR。相比(bi)之下，数(shu)字 PCR (dPCR) 或液(ye)滴数(shu)字 PCR (ddPCR) 使用(yong)(yong)类(lei)似(si)的(de)化学(xue)方法(fa)检(jian)测(ce) DNA 序列，但在许(xu)多(duo)微小体积或液(ye)滴中进(jin)行检(jian)测(ce)，利用(yong)(yong)数(shu)学(xue)的(de)力量(liang)提高(gao)信噪(zao)比(bi)。

虽然 qPCR 和(he) dPCR 有很多相似之处和(he)不(bu)(bu)同之处，但在与(yu) PCR 专家交谈时(shi)，有几个(ge)重要的(de)(de)品质(zhi)更加(jia)突出。随着时(shi)间的(de)(de)推移，PCR 技术在不(bu)(bu)断发展(zhan)，因此这些品质(zhi)也(ye)可能会(hui)随之改(gai)变。本文旨在讨论当今 qPCR 和(he) dPCR 技术之间的(de)(de)一(yi)些重要区别，以及它们在不(bu)(bu)同领域的(de)(de)最佳应用。

01

灵敏度，以及绝对与相对定量

02

在实验室和诊所(suo)中越来越多地(di)使用 dPCR

dPCR 的(de)灵敏度提(ti)高使得研究实(shi)验(yan)室和(he)诊所都受益。“随着细胞和(he)基因治(zhi)疗研究和(he)开发的(de)不断发展，开发人员越来越多地转向 dPCR 来精确测量不同的(de)目标(biao)，包括工程(cheng)病毒载体、基因编辑事(shi)件、质(zhi)粒(li)和(he)完整衣壳，”Paul Hung 表(biao)示。

在临床领(ling)域，如(ru)肿(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)学(xue)和(he)器官移(yi)植等方面，dPCR 检测(ce)(ce)稀有(you) DNA 的(de)(de)(de)(de)能力以(yi)(yi)及量(liang)化稀有(you) DNA 中微小(xiao)但有(you)显著的(de)(de)(de)(de)倍数变(bian)化，也受到了青睐。例如(ru)，dPCR 被用(yong)于检测(ce)(ce)癌症(zheng)患者的(de)(de)(de)(de)循环肿(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu) DNA，并评估细(xi)胞和(he)基因(yin)(yin)治(zhi)(zhi)疗的(de)(de)(de)(de)正确剂量(liang)。“随着精准医学(xue)变(bian)得越(yue)来越(yue)主流，我们(men)预计(ji) ddPCR 将在临床中变(bian)得更(geng)(geng)加普遍，因(yin)(yin)为(wei) ddPCR 可以(yi)(yi)检测(ce)(ce)肿(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)负荷响应(ying)癌症(zheng)治(zhi)(zhi)疗的(de)(de)(de)(de)微小(xiao)变(bian)化，”Marwan Alsarraj 表(biao)示。“例如(ru)，使(shi)用(yong) ddPCR 进(jin)行(xing)连续监测(ce)(ce)可以(yi)(yi)使(shi)肿(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)学(xue)家识别治(zhi)(zhi)疗后(hou)有(you)复(fu)发风险的(de)(de)(de)(de)患者。”然(ran)而(er)，在某些(xie)情(qing)况下，qPCR仍然(ran)是临床应(ying)用(yong)的(de)(de)(de)(de)首选方法，因(yin)(yin)为(wei)它更(geng)(geng)快速，更(geng)(geng)易于使(shi)用(yong)，并且可以(yi)(yi)在更(geng)(geng)大的(de)(de)(de)(de)样本集中进(jin)行(xing)相对定量(liang)。

03

动态范(fan)围和灵活(huo)性

尽管 dPCR 在灵敏度方面表(biao)(biao)(biao)现出色，但在许(xu)多(duo)其(qi)他(ta)应(ying)用中，qPCR 仍然(ran)是最(zui)佳选择。"我(wo)们(men)建议(yi)我(wo)们(men)的(de)客户在基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)(biao)(biao)达中使用 qPCR，因(yin)(yin)为它(ta)的(de)动态范(fan)围(wei)很广(guang)；其(qi)量(liang)化不同表(biao)(biao)(biao)达水平、区分(fen)剪接变(bian)体和多(duo)重分(fen)析的(de)能力；及其(qi)高(gao)通量(liang)应(ying)用和自(zi)动化的(de)能力，" Marwan Alsarraj 表(biao)(biao)(biao)示。实(shi)际上，在实(shi)验(yan)室和监(jian)管环境中，qPCR 更为广(guang)泛(fan)应(ying)用，并且被广(guang)泛(fan)用于基(ji)(ji)因(yin)(yin)、健康(kang)状况或传染病的(de)筛查。

在(zai)分析大(da)量样本时，qPCR 可能比 dPCR 更为经(jing)济实惠。"qPCR 本质上(shang)是一(yi)种(zhong)灵活(huo)且具有成本效益的(de)技术，可满足许多研究(jiu)(jiu)需求(qiu)，使研究(jiu)(jiu)人员能够选(xuan)择(ze)适合(he)其特定需求(qiu)的(de)耗材，包(bao)括(kuo)多种(zhong)反(fan)应化(hua)学、分析选(xuan)项和易于(yu)互(hu)换的(de)塑(su)料，" Paul Hung 表示。"在(zai)生物制(zhi)药行(xing)业，qPCR 被用于(yu)单克隆抗体(ti)、疫苗、细胞和基(ji)(ji)因治(zhi)疗以及生物仿制(zhi)药的(de)制(zhi)造过程中，作为质量控制(zhi)和基(ji)(ji)因分析的(de)工具。"

随着(zhe)不断(duan)(duan)的(de)创(chuang)新(xin)和广(guang)泛的(de)使用(yong)，qPCR 的(de)应用(yong)只会扩(kuo)大(da)。"科学家们不断(duan)(duan)发现使用(yong) qPCR 的(de)新(xin)方法，因为它已经从基因表达(da)扩(kuo)展(zhan)到制造和诊断(duan)(duan)的(de)过程测试，"Alsarraj 表示。"我(wo)们希(xi)望随着(zhe)技术核心(xin)应用(yong)的(de)成(cheng)熟，创(chuang)新(xin)将继续下去。"

04

尽管 qPCR 曾(ceng)经在(zai)多重(zhong)检(jian)测(ce)方面具有优势，但数字 PCR（dPCR）正(zheng)在(zai)迅速成为发(fa)展(zhan)更高的(de)多重(zhong)检(jian)测(ce)功能的(de)平台(tai)(tai)。例如，Stilla Technologies 的(de) naica ®系(xi)统等平台(tai)(tai)可(ke)以运(yun)行(xing) 30 重(zhong)或(huo)更多的(de) dPCR 反(fan)应。“一些客户可(ke)以在(zai) naica ®系(xi)统上运(yun)行(xing)与在(zai) qPCR 仪器上相同(tong)的(de)分(fen)析，但他(ta)(ta)们只运(yun)行(xing)一次样(yang)品并获(huo)得(de)绝对(dui)定量，而不是依(yi)赖标准曲(qu)线并不得(de)不重(zhong)复运(yun)行(xing)他(ta)(ta)们的(de)样(yang)品，”Stilla Technologies 全球营销和(he)(he)商(shang)业运(yun)营副总裁 Matthew Grow 表示。“在(zai) naica ®系(xi)统为研究人员提供了查(cha)看扩增和(he)(he)检(jian)测(ce)效(xiao)率的(de)能力，一直到单(dan)个液滴的(de)水平，每(mei)个 PCR 反(fan)应在(zai)他(ta)(ta)们珍贵的(de)样(yang)本中并行(xing)发(fa)生。”

随(sui)着 dPCR 能够检测稀有基因(yin)表达或癌症相关的(de)(de)拷(kao)贝(bei)数(shu)变异事件，更多(duo)(duo)的(de)(de)多(duo)(duo)路复(fu)用可能会揭示(shi)更多(duo)(duo)未来使用的(de)(de)途径。“多(duo)(duo)重 dPCR 是对当前下一代测序技术的(de)(de)出色补充(chong)，可以让(rang)医院(yuan)实验室有机会进行(xing)更多(duo)(duo)的(de)(de)内(nei)部(bu)患者(zhe)检测，而不必与外包或集中(zhong)式实验室合作，”Matthew Grow 指出。